Кассетный мутагенез

Кассетный мутагенез * касетны мутагенез * plate-holder mutagenesis or site-directed — введение участков узнавания R1 и R2, которые отсутствуют в экспрессирующем плазмидном векторе, в целевую последовательность, находящуюся в составе ДНК фага М13 в непосредственной близости от предполагаемого места введения мутации с 51- и 31-стороны сайт-направленным мутагенезом. После этого ген из ДНК фага М13 перестраивают в экспрессирующую плазмиду. Полученную плазмиду R1 и R2 гидролизуют и добавляют к ней смесь синтетических двухцепочечных сегментов, которые после встройки восстанавливают последовательность гена, за исключением триплета, кодирующего определенную аминокислоту. После трансформации клеток E. coli проводят секвенирование независимых клонов для идентификации плазмид, содержащих разные замены целевого триплета. Данный подход был использован для введения сайт-направленных мутаций в ген субтилизина Bacillus subtilis. Было известно, что субтилизин легко инактивируется при химическом окислении и первичным местом такой инактивации является Met222. Поэтому решили изучить влияние аминокислотных замен в этом сайте, как на ферментативную активность субтилизина, так и на его устойчивость к химическому окислению. Для этого методом К. м. получили 19 вариантов субтилизина, у которых Met222 был последовательно замещен всеми другими аминокислотами, используемыми при синтезе белков in vivo. Все 20 форм субтилизина нарабатывали, используя вектор экспрессии, в клетках Bacillus subtilis и изучали свойства полученных вариантов белка. Оказалось, что единичная замена Met222 на другие аминокислоты приводит к вариациям в ферментативной активности от 0,3 до 138% от уровня удельной активности нативного фермента. Анализ показал, что замена Met222 на аланин, серин или цитозин значительно повышает устойчивость субтилизина к воздействию химических окислителей. Т. обр., методом сайт-направленного мутагенеза можно создавать ферменты, имеющие повышенную термостабильность или устойчивость к окислительной инактивации, а также повышенную удельную активность. Придание таких свойств ферментам имеет большое значение для промышленных процессов. Д. Уэллс и соавт. разработали процедуру К. м. в 1985 г.